白菜(Brassica campestris L. ssp. pekinensis (Lour.) Olsson)起源于我国，是我国种植面积最大的蔬菜，也是我国北方冬春季节食用的主要蔬菜之一，培育和推广优良大白菜品种是我国大白菜生产健康发展的重要保证。大白菜新品种的准确鉴定为审定新品种、维护育种家权益提供保障和科学依据。杂交种纯度对大白菜产量有重要影响，目前，品种纯度的鉴定方法主要有3种：形态鉴定法、生化鉴定法和DNA分子标记鉴定法(梅眉和陆璐, 2005)。大田形态鉴定法受季节环境因素限制，周期长，生化标记鉴定法稳定性差，而DNA分子标记鉴定法准确、快速且不受季节环境限制，是种子纯度鉴定技术发展的必然趋势。随着分子生物学的发展，构建杂交种及亲本的DNA指纹图谱成为鉴定和保护杂交种亲本及检测杂种纯度的有效手段。

SSR分子标记技术是DNA分子标记之一，与其他分子标记相比，具有多态性高、操作简单、重复性好、对DNA质量要求不高、扩增谱带少、统计方便等优点(周红伟等, 2010)，已被广泛用于多种农作物(段艳凤等, 2009; 赵静等, 2008; 戴剑等, 2011; 邱红波等, 2010; 薛艳等, 2010; 王通强等, 2009; 刘平武等, 2005; 赵卫国等, 2011; 姚艳梅等, 2008)及蔬菜(李丽等, 2009; 陈琛等, 2011)指纹图谱的构建和杂交种纯度鉴定。

本试验旨在利用SSR分子标记技术构建7个青研大白菜杂交种及其亲本的DNA指纹图谱，检测杂交种纯度，筛选出对杂种具有共显性的SSR引物，同时结合形态鉴定结果，验证利用SSR分子标记进行大白菜杂交种纯度鉴定的准确性和可靠性，为大白菜杂交种真实性鉴别和纯度鉴定提供准确有效的检测方法。

1结果与分析
1.1 SSR多态性引物筛选
用筛选出的10对多态性较好的引物对18份材料进行扩增分析，共扩增出27条遗传多样性条带，平均每对引物的等位位点数为2.7，变化范围为2~3，片段大小在189~348 bp之间。引物P3在18份材料中的扩增结果见图1和图2。
 

图1 引物P3在11份亲本中的扩增电泳图 Figure 1 Amplificaion products by SSR primer P3 in the 11 parental lines

 

图2 引物P3在7份杂交种中的扩增电泳图 Figure 2 Amplificaion products by SSR primer P3 in the 7 hybrids

1.2杂交种及其亲本指纹图谱的构建
从筛选出的10对多态性较好的引物中选取5对核心引物(P1, P3, P18, P21和P16)用于构建7份大白菜杂交种及其11份亲本的指纹图谱(表1)，对于某一大白菜杂交种或亲本材料，5对核心引物特异带的组合即为该杂交种或亲本材料的指纹，可用于判别品种的真实性，鉴定杂交种纯度。由表3可以看出，引物P1、P3的扩增指纹组合在一起可以将3-2与其他17份材料区别开；引物P1、P3、P18的扩增指纹组合在一起可以分别将3-2、5-2、1-2、2-2、4-1、青研早9号、青研桔15、青研春白一号、青研春白2号与其他材料区别开；引物P1、P3、P21的扩增指纹组合在一起可以分别将3-2、6-1、7-1、青研春白3号、青研夏白2号与其他材料区别开；引物P1、P3、P18、P21的扩增指纹组合在一起可以分别将3-2、5-2、1-2、2-2、4-1、青研早9号、青研桔15、青研春白一号、青研春白2号、6-1、7-1、青研春白3号、青研夏白2号、5-1、CH34与其他材料区别开；引物P1、P3、P18、P21、P16的扩增指纹组合在一起可以将18份材料全部区别开。鉴别各个材料的引物组合见表2。
 

表1 大白菜杂交种及其亲本的指纹图谱 Table 1 SSR fingerprints of 7 Chinese cabbage hybrids and their parents

 

表2 鉴别各个材料的引物组合 Table 2 Primer combinations for identifying each material

 

表3 杂交种纯度鉴定的引物筛选 Table 3 Primers selected for hybrids purity test

1.3杂交种纯度鉴定
1.3.1苗期形态性状调查鉴定杂交种纯度
通过苗期形态性状调查，杂交种青研桔15的两个亲本：2-1叶毛表现为有，2-2叶毛表现为无，杂交种青研桔15表现有毛，100个青研桔15杂交种单株中，5个单株叶毛表现为无，95个单株叶毛表现为有，杂交种纯度为95%。

1.3.2 SSR分子标记鉴定杂交种纯度
由表1 (指纹图谱)得出在各杂交种中产生双亲互补带型的特异性引物(表3)。例如，引物P3在杂交种青研早9号中扩增出双亲1-1和1-2的互补带型，在青研桔15和青研春白一号中也分别扩增出双亲的互补带型，可用于杂交种青研早9号、青研桔15和青研春白一号的纯度鉴定。

用引物P3对杂交种桔15的100个单株及双亲进行PCR扩增(扩增结果见图3)，扩增产物的检测结果显示：在双亲P3(2-1)和P4(2-2)中分别扩增出一条特征带，其片段大小分别为276 bp和253 bp，青研桔15的100个单株中有95株为双亲的互补带型，没有与P3带型相同的单株，有5株与P4带型相同(图3中的2, 6, 32, 33和47号单株)，这5个单株在苗期性状调查时叶毛就表现为无，说明由分子标记鉴别出的杂种是可靠的。由此，引物P3检测的杂交种青研桔15的纯度为95%，与苗期性状调查鉴定结果相吻合。
 

图3 引物P3对青研桔15的纯度鉴定 Figure 3 Purity identification of Qinyanju 15 amplified by SSR primer P3

2讨论
本试验利用SSR分子标记技术建立了青研系列7个杂交种及其11个亲本的DNA指纹图谱，从研究结果可以看出，同一SSR引物在不同的杂交种亲本中扩增的带型可能不同(如引物P3在1-1、1-2和3-2中扩增的带型不同)，其相应杂交种的带型也不同(如引物P3在1F1, 3F1中扩增的带型不同)。指纹图谱构建过程中筛选出了5对核心引物(P1, P3, P18, P21, P16)，利用这5个SSR引物的不同组合可将不同杂交种及其亲本区别开，可用于大白菜杂交种真实性鉴定和杂种纯度鉴定。

研究中对7份杂交种均筛选出了相应的可用于纯度鉴定的SSR引物(表3)。选用其中一对核心引物P3对杂交种青研早9号、青研桔15和青研春白一号进行了纯度鉴定，并把青研桔15的苗期形态性状调查结果与SSR分子标记鉴定结果进行比较，试验结果表明，利用SSR分子标记的纯度检测结果与苗期形态性状调查结果相吻合，验证了利用SSR分子标记技术进行杂交种纯度鉴定的准确性和可行性。

SSR为共显性标记，多态性信息量大，利用SSR分子标记技术构建大白菜杂交种及其亲本的DNA指纹图谱并进行杂交种纯度鉴定，具有分辨力强、准确度高、成本低等优点，既可弥补种子贮藏蛋白电泳和同工酶电泳技术受组织特异性影响的不足，又可克服其他现代分子标记技术RAPD、RFLP、AFLP等稳定性和可靠性差、费用高、操作繁琐等缺点，因此，利用SSR分子标记技术构建大白菜杂交种及其亲本的指纹图谱更准确、快捷、经济，对亲本知识产权的保护及杂交种推广具有重要的意义。

3材料与方法
3.1材料
供试材料是由青岛市农业科学研究院大白菜课题组提供的7个大白菜杂交种及其11个亲本。2011年7月单粒播于128孔穴盘中，每个杂交种播种100个单株，每个亲本播种8个单株，15 d后取样。供试材料信息见表4。
 

表4 供试亲本及其杂交种 Table 4 The names of parental lines and hybrids investigated

3.2方法
3.2.1苗期形态性状调查
将杂交种青研桔15的100个单株和两个亲本各8个单株在播种15 d后进行编号，并逐株调查叶毛有无。

3.2.2 DNA的提取
采用上海生物工程公司生产的植物基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA，用ND-1000紫外分光光度计测定其浓度，稀释DNA至10 ng/μL，保存于4℃备用。

3.2.3 SSR引物筛选与PCR扩增
从60对引物中筛选出了10对多态性较好的引物对18份材料进行扩增分析，从中选出5对多态性高、重复性好、条带清晰的引物用于构建指纹图谱(引物信息见表5)。PCR反应体系总体积为15 μL：10×Taq Buffer with KCl 1.5 μL，25 mmol/L MgCl₂ 1.5 μL，2 mmol/L dNTPs 0.95 μL，1 U/μL Taq酶1 μL，66 mg/L引物1 μL，10 mg/L模板DNA 8 μL，ddH₂O 1.05 μL。PCR反应程序为：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，合适温度退火45 s，72℃延伸45 s，共34个循环；72℃延伸10 min后4℃保存。
 

表5 多态性引物信息 Table 5 Polymorphism prime information of SSR used in the study

3.2.4 SSR引物筛选与PCR扩增
恒功率50 W电泳90 min。电泳结束后，采用Bassam等(1991)建立的染色方法染色，晾干后在X线胶片观察灯下拍照并统计条带。扩增条带在相同迁移率位置上有带记为“1”，没带记为“0”。

作者贡献
田术美、张清霞是本研究的实验设计和实验研究的执行人；田术美完成数据分析，论文初稿的写作；司朝光、张淑霞和王媛参与实验设计，试验结果分析；杨晓云是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家十一五科技支撑计划项目(2008BADB1B01-3)和山东省现代农业产业技术体系蔬菜创新团队建设任务共同资助。感谢青岛市农业科学研究院的盖红梅博士在论文修改中提出有益的建议。

参考文献
Bassam B.J., Caetano-Anollés G., and Gresshoff P.M., 1991, Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels, Anal. Biochem., 196: 80-83

Chen C., Zhang X.T., Cheng F., Zhuang M., Liu Y.M., Yang L.M., Zhang Y.Y., and Fang Z.Y., 2011, Establishment of SSR fingerprinting on autumn cabbage hybrids and their parents, Yuanyi Xuebao (Acta Horticulturae Sinica), 38(1): 159-164 (陈琛, 张兴桃, 程斐, 庄木, 刘玉梅, 杨丽梅, 张扬勇, 方智远, 2011, 秋甘蓝品种的SSR指纹图谱的构建, 园艺学报, 38(1): 159-164)

Dai J., Hong D.L., and Wu Y., 2011, SSR fingerprints and genetic similarity analysis of 33 parents for hybrid rice, Xibei Zhiwu Xuebao (Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica), 31(8): 1543-1550 (戴剑, 洪德林, 吴燕, 2011, 33份杂交稻亲本的SSR指纹图谱构建及遗传相似性分析, 西北植物学报, 31(8): 1543-1550)

Duan Y.F., Liu J., Bian C.S., Duan S.G., Xu J.F., and Jin L.P., Construction of fingerprinting and analysis of genetic diversity with SSR markers for eighty-eight approved potato cultivars (Solanum tuberosum L.) in China, Zuowu Xuebao (Acta Agronomica Sinica), 35(8): 1451-1457 (段艳凤, 刘杰, 卞春松, 段绍光, 徐建飞, 金黎平, 2009, 中国88个马铃薯审定品种SSR指纹图谱构建与遗传多样性分析, 作物学报, 35(8): 1451-1457)

Li L., He W.M., Ma L.P., Liu P.Y., Xu H.M., Xu J.B., and Zheng X.Y., 2009, Construction Chinese cabbage (Brassica rapa L.) core collection and its EST-SSR fingerprint database by EST-SSR molecular markers, Jiyinzuxue Yu Yingyong Shengwuxue (Genomics and Applied Biology), 28(1): 76-88 (李丽, 何伟明, 马连平, 刘庞源, 徐海明, 徐家柄, 郑晓鹰, 2009, 用EST-SSR分子标记技术构建大白菜核心种质及其指纹图谱库, 基因组学与应用生物学, 28(1): 76-88)

Liu P.W., Zhou G.L., Yang G.S., and Fu Y.D., 2005, Fingerprints construction of hybrid parents in Brassica napus and its utilization in hybrid purity test, Zuowu Xuebao (Acta Agronomica Sinica), 31(5): 640-646 (刘平武, 周国岭, 杨光圣, 傅廷栋, 2005, 双低甘蓝型油菜杂交种亲本指纹图谱构建和杂交种纯度鉴定, 作物学报, 31(5): 640-646)

Mei M., and Lu L., 2005, Application of DNA molecular markers technique on quality testing of crop seed, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 3(1): 129-134 (梅眉, 陆璐, 2005, DNA分子标记技术在农作物种子质量检验中的应用, 分子植物育种, 3(1): 129-134)

Qiu H.B., Ye Y.S., and Peng Z.H., 2010, Establishment fingerprinting for main maize inbred lines of karst high elevation mountainous area by SSR markers, Yumi Kexue (Journal of Maize Sciences), 18(4): 63-65 (邱红波, 叶雨胜, 彭忠华, 2010, 喀斯特高海拔山区玉米骨干自交系SSR指纹图谱的构建, 玉米科学, 18(4): 63-65)

Wang T.Q., Ma X.F., and Wu Y.X., 2009, Fingerprints construction of hybrid parents in Brassica napus of the series of guiza and its utilization in hybrid purity test, Shipin Yu Shengwu Jishu Xuebao (Journal of Food Science and Biotechnology), 28(3): 377-384 (王通强, 马晓峰, 吴有享, 2009, 油菜杂种及亲本指纹图谱构建和杂种纯度鉴定, 食品与生物技术学报, 28(3): 377-384)

Xue Y., Zhang X.Y., Sha H., Li X.Y., Sun J., and Li B.C., 2010, Construction of fingerprinting map based on SSR and identification of cultivars for earliness cultivars in upland cotton in Xinjiang, Mianhua Xuebao (Cotton Science), 22(4): 360-366 (薛艳, 张新宇, 沙红, 李雪源, 孙杰, 李保成, 2010, 新疆早熟棉品种SSR指纹图谱构建与品种鉴别, 棉花学报, 22(4): 360-366)

Yao Y.M., Xu L., Hu Q., and Du D.Z., 2008, Analysis of spring rapeseed hybrids and their parental lines in Qinghai province by SSR markers, Zhongguo Youliao Zuowu Xuebao (Chinese Journal of Oil Crop Sciences), 30(4): 406-410 (姚艳梅, 徐亮, 胡琼, 杜德志, 2008, 青海省几个主要春性甘蓝型油菜杂交种的SSR分析, 中国油料作物学报, 30(4): 406-410)

Zhao W.G., Wang H., Li D.R., Tian J.H., Zhao Y.J., Li B.J., Wang X.D., and Wang A.N., 2011, Fingerprinting construction of Brassica napus germplasm with super-high oil content and main rapeseed cultivars, Zhiwu Yichuan Ziyuan Xuebao (Journal of Plant Genetic Resources), 12(6): 904-909 (赵卫国, 王灏, 李殿荣, 田建华, 赵亚军, 李保军, 王晓东,王爱娜, 2011, 甘蓝型特高含油量油菜种质及其主栽品种的指纹图谱构建, 植物遗传资源学报, 12(6): 904-909)

Zhao J., Zhang R.H., Zhang X.H., and Xue J.Q., 2008, Establish fingerprinting for the main inbred lines of Shanxi province by SSR markers, Yumi Kexue (Journal of Maize Sciences), 16(2): 26-29 (赵静, 张仁和, 张兴华, 薛吉全, 2008, 利用SSR技术构建陕西省主要玉米自交系的指纹图谱, 玉米科学, 16(2): 26-29)

Zhou H.W., Yao Y.M., Fu Z., and Du D.Z., 2010, Fingerprint construction of hybrids and related parents in Brassica napus and hybrid purity test, Xibei Nongye Xuebao (Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica), 19(3): 81-86 (周红伟, 姚艳梅, 付忠, 杜德志, 2010, 春性双低甘蓝型油菜杂交种和亲本指纹图谱构建及杂交种纯度鉴定, 西北农业学报, 19(3): 81-86)